同源重組是一種十分保守的生物學(xué)機(jī)制，主要參與DNA雙鏈斷裂的準(zhǔn)確修復(fù)和減數(shù)分裂過(guò)程中的非等位基因重組，在維持基因組穩(wěn)定性和促進(jìn)遺傳多樣性等方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。同時(shí)，多種環(huán)境污染物可引起最為嚴(yán)重DNA損傷（雙鏈斷裂），產(chǎn)生遺傳毒性。而同源重組修復(fù)可有效消除這類遺傳毒性。同源重組步驟繁多，需要多種蛋白質(zhì)機(jī)器的協(xié)同參與，并受到精細(xì)調(diào)控。RecA/Rad51家族蛋白在單鏈DNA上組裝形成的核蛋白纖維絲（nucleoprotein filament）具有同源尋找和識(shí)別功能，其介導(dǎo)的與同源雙鏈DNA之間的鏈交換過(guò)程是同源重組的核心步驟，對(duì)其分子機(jī)制的解析是該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)。在前期研究工作中，汪海林團(tuán)隊(duì)通過(guò)發(fā)展新穎的分析方法（包括毛細(xì)管電泳-激光誘導(dǎo)熒光偏振、酶切保護(hù)介導(dǎo)的單DNA片段分子測(cè)序等）可解析RecA蛋白在單鏈DNA上的動(dòng)態(tài)組裝。研究表明，在生理?xiàng)l件下（即存在有效的ATP水解），RecA在單鏈DNA組裝形成低密度、不飽和的核蛋白纖維絲結(jié)構(gòu)，含有大量裸露（未結(jié)合RecA蛋白）的核苷酸位點(diǎn)。經(jīng)典模型中，RecA全覆蓋的ssDNA形成的核蛋白纖維絲才能進(jìn)DNA鏈交換。因此，他們的這一發(fā)現(xiàn)是對(duì)過(guò)去經(jīng)典模型的顛覆。同時(shí)研究人員提出了新的科學(xué)問(wèn)題：核蛋白纖維絲結(jié)構(gòu)中RecA-缺失區(qū)域是如何進(jìn)行鏈交換的？為了回答這一問(wèn)題，需要對(duì)鏈交換這一過(guò)程進(jìn)行精細(xì)測(cè)量。然而，由于RecA蛋白介導(dǎo)的鏈交換反應(yīng)非常迅速，對(duì)其動(dòng)態(tài)過(guò)程進(jìn)行高分辨解析非常困難。針對(duì)這一難題，該團(tuán)隊(duì)將鏈交換核心過(guò)程進(jìn)行有效“分解”，即雙鏈的分離和新堿基配對(duì)的形成兩個(gè)步驟。同時(shí)通過(guò)設(shè)計(jì)一系列非常規(guī)的DNA底物以及發(fā)展雙色交替激發(fā)-單分子熒光成像技術(shù)在單分子水平對(duì)這兩個(gè)關(guān)鍵步驟進(jìn)行實(shí)時(shí)觀察，研究不飽和組裝RecA核蛋白纖維絲介導(dǎo)DNA鏈交換的分子機(jī)制。 

　　該團(tuán)隊(duì)利用截短的單鏈DNA作為入侵鏈，發(fā)現(xiàn)其仍能與全長(zhǎng)的供體雙鏈DNA進(jìn)行有效的鏈交換反應(yīng)，表明供體雙鏈上“多出”的DNA片段在此過(guò)程中也發(fā)生了雙鏈解旋。由于缺少對(duì)應(yīng)的入侵鏈，這一“多出”的部分不能被RecA蛋白直接接觸，研究人員將這種不依賴RecA直接接觸的解旋作用命名為RecA核蛋白纖維絲的側(cè)翼鏈分離活性，并進(jìn)一步利用兩端同時(shí)延長(zhǎng)的供體雙鏈作為底物，對(duì)側(cè)翼鏈分離所需的能量進(jìn)行了評(píng)估。在此基礎(chǔ)上，他們通過(guò)將1-3個(gè)不具有RecA成核能力的短片段（15個(gè)堿基長(zhǎng)度）與較長(zhǎng)的DNA片段（48-78個(gè)堿基長(zhǎng)度）進(jìn)行化學(xué)串聯(lián)，構(gòu)建了一種新的入侵鏈底物進(jìn)行鏈交換反應(yīng)。在ATP水解條件下，這些短片段不能被RecA結(jié)合，也不能與其對(duì)應(yīng)的同源雙鏈DNA發(fā)生鏈交換，但仍然具備堿基配對(duì)能力，因此能夠用于模擬不飽和組裝核蛋白纖維絲上未被RecA結(jié)合的裸露核苷酸位點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相比于截短的入侵鏈，偶聯(lián)有短片段的入侵鏈具有更高的鏈交換能力，表明這些短片段的堿基配對(duì)能力能夠促進(jìn)側(cè)翼鏈雙鏈分離活性，使其達(dá)到一個(gè)較長(zhǎng)的范圍（>45個(gè)堿基長(zhǎng)度），揭示了長(zhǎng)程側(cè)翼鏈雙鏈分離活性的存在。他們利用雙色交替激發(fā)-單分子熒光成像技術(shù)對(duì)不同底物之間的鏈交換過(guò)程進(jìn)行了實(shí)時(shí)觀測(cè)并比較了它們的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，發(fā)現(xiàn)側(cè)翼鏈分離是鏈交換反應(yīng)的限速步驟，而入侵鏈與互補(bǔ)鏈的堿基配對(duì)可以通過(guò)降低能量壁壘加速這一過(guò)程。 

　　基于上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，研究人員提出了一種側(cè)翼鏈分離依賴的DNA鏈交換模型，揭示了不飽和組裝RecA核蛋白纖維絲介導(dǎo)DNA鏈交換的分子機(jī)制。這一發(fā)現(xiàn)為深入理解同源重組及相關(guān)生物過(guò)程提供了新的方向。

　　相關(guān)研究工作得到國(guó)家自然科學(xué)基金的資助。

　　論文鏈接 

不飽和組裝RecA核蛋白纖維絲介導(dǎo)DNA鏈交換的分子模型