CRISPR-Cas系統(tǒng)廣泛存在于細(xì)菌、古菌和某些細(xì)菌的病毒中（bacteriophage），可以特異性識(shí)別并降解外源入侵的基因。根據(jù)CRISPR-Cas系統(tǒng)干擾機(jī)制的不同，這些系統(tǒng)被分為兩類，即Class1和Class2。Class1由多個(gè)蛋白構(gòu)成效應(yīng)復(fù)合物（包括I、III和IV型），Class2由單個(gè)蛋白行使功能（包括II、V和VI型）。III型CRISPR-Cas系統(tǒng)進(jìn)一步可分為III-A和III-B兩個(gè)亞型，其特點(diǎn)是具有Cas10蛋白。Cas10通過(guò)與Cas5、多個(gè)拷貝的Cas11、Cas7以及一條crRNA（CRISPR RNA）組裝成多亞基效應(yīng)復(fù)合物。III-A和III-B型CRISPR-Cas系統(tǒng)的多亞基構(gòu)成在某種程度上限制了這些系統(tǒng)作為基因編輯和檢測(cè)工具的可操作性。

　　2020年，Makarova等報(bào)道了新型的III型CRISPR-Cas系統(tǒng)，即III-E型CRISPR-Cas系統(tǒng)。生物信息學(xué)分析顯示該系統(tǒng)的關(guān)鍵蛋白（稱為Cas7-11或gRAMP）是一個(gè)包含有數(shù)個(gè)Cas7結(jié)構(gòu)域和一個(gè)Cas11結(jié)構(gòu)域的單鏈蛋白。生化實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明，Cas7-11能夠加工pre-crRNA使之成為成熟的crRNA，且Cas7-11能夠特異性切割單鏈目標(biāo)RNA（target RNA，tgRNA）底物。這一生化特點(diǎn)和VI型CRISPR-Cas系統(tǒng)中的Cas13a相似（Class2），但Cas7-11并不顯示出Cas13a所具有的底物旁切活性，且Cas7-11敲低細(xì)胞RNA時(shí)無(wú)明顯的細(xì)胞毒性，這使得Cas7-11在被改造成為一款可靠的RNA操控工具方面頗具潛能。Cas7-11基因附近含有多個(gè)CRISPR-Cas相關(guān)蛋白，包括Csx29（TPR-CHAT）、Csx30、Csx31和RpoE等。尤其是Csx29，可與Cas7-11形成穩(wěn)定的復(fù)合物，并能夠抑制Cas7-11切割tgRNA的活性。Csx29由N端的TPR結(jié)構(gòu)域和C端的CHAT結(jié)構(gòu)域組成。CHAT結(jié)構(gòu)被認(rèn)為具有可調(diào)控的蛋白酶活性且與細(xì)胞程序性死亡相關(guān)。上述研究揭示了III-E型CRISPR-Cas可能具有全新的免疫應(yīng)答機(jī)制。然而，Cas7-11如何加工pre-crRNA、如何識(shí)別并切割tgRNA，Csx29如何調(diào)節(jié)Cas7-11的活性，Csx29如何被激活等機(jī)制尚不清楚。為了回答這些科學(xué)問(wèn)題，中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所對(duì)來(lái)自Desulfonema ishimotonii菌的DiCas7-11-crRNA復(fù)合物開(kāi)展了結(jié)構(gòu)與功能研究，并解析了一系列該復(fù)合物相關(guān)的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)（圖1）。

　　該研究解析了DiCas7-11-crRNA未結(jié)合底物tgRNA的3.53?的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)分析揭示了DiCas7-11-crRNA結(jié)構(gòu)整體呈現(xiàn)“海馬”狀。DiCas7-11由4個(gè)Cas7L（Cas7-like）結(jié)構(gòu)域（Cas7L1-4）、1個(gè)Cas11L結(jié)構(gòu)域和1個(gè)Insertion結(jié)構(gòu)域組成，且一條長(zhǎng)38nt的crRNA（15 nt 5' handle + 23 nt spacer）貫穿于整個(gè)DiCas7-11蛋白內(nèi)部。15 nt 5' handle和Cas7Ll、Cas7L2緊密結(jié)合，進(jìn)一步的生化實(shí)驗(yàn)證實(shí)Cas7L1保守的殘基His43可切開(kāi)pre-crRNA的-15和-16堿基之間的磷酸二酯鍵以生成成熟的crRNA。為了剖析DiCas7-11-crRNA如何識(shí)別并切割tgRNA，該團(tuán)隊(duì)解析了DiCas7-11-crRNA與tgRNA復(fù)合物的3.64?的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)分析揭示了crRNA和tgRNA形成堿基互補(bǔ)配對(duì)，闡釋了Cas7L2和Cas7L3切割tgRNA的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)。刪除Insertion結(jié)構(gòu)域能夠增強(qiáng)DiCas7-11切割tgRNA活性的同時(shí)不損害其切割底物的特異性和加工pre-crRNA的能力，這表明可通過(guò)刪除Insertion結(jié)構(gòu)域可將DiCas7-11改造成為更小的RNA操控工具。研究進(jìn)一步解析了DiCas7-11-crRNA和含有與5' handle配對(duì)的 3' anti-tag的tgRNA（tgRNA中與crRNA 5' handle對(duì)應(yīng)的部分稱為3' anti-tag）復(fù)合物的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)（3.46?），以及DiCas7-11-crRNA和含有與5' handle不配對(duì)的3' anti-tag的tgRNA復(fù)合物的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)（3.14?），同時(shí)，從結(jié)構(gòu)和生化上揭示了tgRNA的3' anti-tag不參與DiCas7-11-crRNA切割底物活性的調(diào)節(jié)，這不同于Cas13a的重要性特性。

　　為了探究DiCsx29調(diào)節(jié)DiCas7-11切割tgRNA的分子機(jī)制，科研人員解析了DiCas7-11-crRNA-DiCsx29復(fù)合物3.29?的電鏡結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)了DiCas7-11-crRNA結(jié)構(gòu)中兩段觀察不到的區(qū)域即FR1（366-397 aa）和FR2（1316-1337 aa）在結(jié)合DiCsx29后變得穩(wěn)定有序。FR1與FR2通過(guò)形成一對(duì)氫鍵共同阻礙了tgRNA與crRNA在A1至G9的堿基配對(duì)，從而調(diào)控了DiCas7-11切割tgRNA活性，這一結(jié)論隨之得到生化實(shí)驗(yàn)的證實(shí)。此外，DiCas7-11-crRNA-Csx29切割tgRNA同樣不依賴5' handle堿基的配對(duì)與否。通過(guò)DiCas7-11-crRNA-Csx29與III-A型CRISPR-Cas系統(tǒng)以及相關(guān)結(jié)構(gòu)的比較，研究推測(cè)DiCsx29活性的激活可能依賴tgRNA 3'anti-tag的調(diào)控，這一假設(shè)得到該研究后續(xù)生化實(shí)驗(yàn)的支持。當(dāng)tgRNA的3' anti-tag與crRNA 5' handle堿基不配對(duì)時(shí)，DiCsx29蛋白酶活性被激活并切割DiCsx30，被切割后的DiCsx30可能引起宿主的死亡（圖2）。該研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，當(dāng)tgRNA與crRNA 5' handle堿基不配對(duì)大于4 nt，且與spacer堿基配對(duì)不少于12 nt時(shí)，DiCsx29均可以有效切割DiCsx30。由于該蛋白的重要性，近期有多個(gè)類似的工作發(fā)表，與這些工作相比，研究人員在crRNA的3' 端區(qū)域充當(dāng)“種子區(qū)域”（seed region）的作用來(lái)調(diào)節(jié)DiCas7-11活性，以及利用FR1與FR2所形成的“離子鎖”的別構(gòu)效應(yīng)來(lái)調(diào)節(jié)DiCas7-11活性等方面提出了較為新穎的觀點(diǎn)（圖2）。

　　該研究詳細(xì)闡述了DiCas7-11加工pre-crRNA和切割tgRNA的機(jī)制、DiCsx29對(duì)DiCas7-11切割tgRNA活性調(diào)控的機(jī)制以及DiCsx29蛋白酶活性激活的調(diào)控機(jī)制。該工作豐富了科學(xué)家對(duì)CRISPR-Cas系統(tǒng)的認(rèn)知，有助于將DiCas7-11改造為新型的、無(wú)細(xì)胞毒性的RNA操控工具。

　　1月26日，相關(guān)研究成果以Cryo-EM structure and protease activity of the type III-E CRISPR-Cas effector為題，發(fā)表在Nature Microbiology上。研究工作得到科技部、中科院戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專項(xiàng)的支持。該研究樣品的鑒定、冷凍電鏡樣品的篩查和數(shù)據(jù)收集工作得到生物物理所蛋白質(zhì)科學(xué)研究平臺(tái)和生物成像中心等的幫助。

　　論文鏈接 

圖1.A、Desulfonema ishimotonii III-E型CRISPR-Cas系統(tǒng)的基因組成形式；B、解析的一系列DiCas7-11-crRNA相關(guān)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)。

圖2.DiCas7-11-crRNA-Csx29活性的調(diào)節(jié)