于濤團隊致力于利用合成生物學方法，解決可持續(xù)制造、綠色能源的生物存儲與糧食安全等重大問題。前期工作中，團隊成功實現(xiàn)了空氣中CO₂到葡萄糖與脂肪酸的制備（Nature Catalysis，2022），該工作開發(fā)的合成能量系統(tǒng)（細胞雙引擎），進一步提高了脂肪酸的轉化率，并為下一步開發(fā)可再生能源的生物儲能技術打下了基礎。 

　　細胞在生長過程中合成大分子、構建碳骨架，這些過程消耗能量，且需要克服底物和生物量之間的還原度差異。對于脂質等高價值的儲能化合物，其還原度遠高于葡萄糖等底物，細胞往往需要額外的還原力和能量來合成這些化合物。而這無疑需要對細胞的代謝網絡進行重構，因為細胞獲取能量和還原力、合成大分子和構建碳骨架的目的是為自身生長，而不是產品合成。因此，研究人員構想，是否有可能從頭構建一個合成的能量系統(tǒng)，其是否可以取代內源的能量系統(tǒng)為細胞供應能量支撐生長？其是否能為化學品合成提供額外的能量和還原力？細胞內的反應高度協(xié)作，胞內的能量和物質組成維持在一定的比例，細胞是否能接受過量的NADPH和NADH？ 

　　研究團隊通過理性重排還原代謝，在酵母細胞內構建了一個新型合成能量系統(tǒng)，利用重復的單脫羧反應和轉氫循環(huán)實現(xiàn)NADPH和NADH的合成，并進一步轉變?yōu)槟芰窟M行釋放。該系統(tǒng)由三個模塊組成：磷酸戊糖（Pentose Phosphate，PP）循環(huán)、轉氫循環(huán)和外部呼吸鏈（圖1）。 

　　重復脫羧是細胞還原代謝的基礎，因此要構建一個新的能量系統(tǒng)首先就是要構建一個重復脫羧循環(huán)。磷酸戊糖途徑中，6-磷酸葡萄糖（G6P）被催化為5-磷酸核糖（R5P）時失去一分子CO₂，生成2分子NADPH，此為氧化階段；之后C5分子經可逆重排，最終重構為6-磷酸果糖（F6P）和3-磷酸甘油醛（G3P），此為非氧化階段；G3P經部分糖異生途徑可以回到G6P，再一次進入氧化階段，這樣就構成了PP循環(huán)。在這個循環(huán)中，1分子葡萄糖徹底氧化可以生成12分子NADPH。NADPH是細胞內的還原力通量，而NADH經過氧化呼吸鏈可以生成ATP。研究人員過表達酵母內源谷氨酸鹽轉氫酶GDH1和GDH2，在胞質內實現(xiàn)1分子NADPH不可逆轉變?yōu)?分子NADH的轉氫循環(huán)（圖2a）。 

　　研究人員選擇了一株消除葡萄糖效應的丙酮酸脫羧酶缺陷菌株E1B[1]（重命名為SynENG001）來測試PP循環(huán)和轉氫循環(huán)的碳通量。該菌株以氧化磷酸化為主要供能過程，可以在單一葡萄糖碳源上生長，且具有較好的胞質NADH平衡能力。研究人員敲除了磷酸果糖異構酶基因pgi1，打斷了糖酵解途徑，提高了PP循環(huán)碳通量，得到的菌株SynENG064不能以糖為單一碳源生長；而在添加轉氫循環(huán)后，得到的菌株SynENG065在5天內可以生長到OD600 nm=10（圖2b）。由此可推測敲除pgi后胞內的NADPH過量，對細胞生長產生抑制。在野生型酵母內敲除pgi并過表達GDH2僅能部分恢復細胞生長，研究人員推測這是由于轉氫循環(huán)產生的過量NADH抑制細胞生長，因此細胞需要一個有效的呼吸鏈來解除胞質內多余的NADH。以上結果證實PP循環(huán)和轉氫循環(huán)運行良好，且兩個模塊有較高的碳通量。 

　　琥珀酸是一種四碳二羧酸，從丙酮酸合成琥珀酸需要細胞提供額外的還原力NADH。研究人員在SynENG001菌株中過表達了琥珀酸合成所需要的各基因，并下調了磷酸果糖激酶（PFK）的表達水平推動碳流更多流向PP循環(huán)，使琥珀酸的產量升至約3.3 g/L（圖3）。在此過程中研究人員還發(fā)現(xiàn)了甘油的積累，這些都說明PP循環(huán)和轉氫循環(huán)導致細胞內的NADH過剩。

　　自然界的產油真菌中線粒體內的異檸檬酸脫氫酶受損會導致油脂的過度生產，因此先前的研究中，研究人員在已優(yōu)化的產自由脂肪酸（Free Fatty Acids，F(xiàn)FAs）菌株動態(tài)調控IDH2的表達，得到菌株Y&Z032[2]。但是搖瓶發(fā)酵后細胞生長和FFAs產量都下降了。研究人員推測這是由于胞內能量供應不足，因此放入了轉氫循環(huán)和外部呼吸鏈，得到的菌株SynENG024生物量相對提高100%，F(xiàn)FA產量提高200%（圖5a-c）。這也進一步印證了合成能量系統(tǒng)可以支持細胞生長和高還原性化合物的生產。 

　　此外，研究人員還過表達不同來源的果糖-1,6-二磷酸酶FBP1來提高NADPH供應（圖5d）；使用不同的啟動子微調NADPH和ATP的比例，但并未觀察到FFAs產量的明顯提高。因此在胞內表達了非氧化糖酵解（Non-oxidative glycolysis，NOG）途徑，將PP途徑部分分流到乙酰輔酶A的合成。如預期所料，F(xiàn)FAs產量提高了30%（圖5e）。這說明最優(yōu)生產需要結合多策略實現(xiàn)。 

　　分批補料發(fā)酵實驗中，研究人員在FFAs生產的最佳菌株SynENG050中恢復了完整功能的TCA循環(huán)來避免高濃度乙醇的積累，又過表達一份FFAs合成途徑來競爭碳源和消耗過多的NADH，得到菌株SynENG058，發(fā)酵后使用Dodecane進行提取，得到20 g/L的FFAs，產率達到0.134 g FFAs/g葡萄糖，為最高理論得率的40%（圖5f）。 

　　生物技術的挑戰(zhàn)之一是如何在剛性代謝網絡的基礎上改變胞內能量（ATP）和還原力（NADH/NADPH）的相對化學計量比，來積累過量能量/還原力進行產品合成。該研究構建了一個合成能量系統(tǒng)，為細胞供給額外的能量和還原力，經過實驗驗證，該系統(tǒng)可替代原有的TCA循環(huán)，可支持高還原度化學品的生產，也可與其他途徑合作高效生產以乙酰輔酶A為前體的化學品。這是第一個通過理性設計構建的合成能量系統(tǒng)。這項研究揭示了細胞能量代謝網絡的可塑性：盡管經過了幾百萬年的進化，細胞的能量代謝網絡依然可以重構。

　　論文鏈接 

圖1 合成能量系統(tǒng)示意圖

　　圖2 通過轉氫循環(huán)解除NADPH過量產生的毒性。a. PP循環(huán)和不可逆的轉氫循環(huán)。b. 轉氫循環(huán)恢復了pgi1缺失導致的生長缺陷。SynENG064菌株敲除了pgi1，SynENG065菌株敲除pgi1同時過表達了GDH1和GDH2（轉氫循環(huán)）

　　圖3 合成能量系統(tǒng)產生過量NADH供給高還原度化學品合成。a. 磷酸果糖激酶下調的PP循環(huán)示意圖。b. PP循環(huán)結合轉氫循環(huán)提高了琥珀酸的生產。c. PP循環(huán)結合轉氫循環(huán)提高了甘油的生產 　 

　　圖4 合成能量系統(tǒng)支持細胞生長。a. 雙能量引擎設計示意圖。b. 雙能量系統(tǒng)的過度脫羧導致細胞生長受損。c. 無合成能量系統(tǒng)時，TCA循環(huán)下調導致細胞生長受損。d. 合成能量系統(tǒng)可替代TCA循環(huán)支持細胞生長　   

　　圖5 合成能量系統(tǒng)提高FFAs生產。a. 雙能量引擎供給FFAs生產示意圖。b. 合成能量系統(tǒng)可替代TCA循環(huán)支持細胞生長。c. 合成能量系統(tǒng)可替代TCA循環(huán)支持FFAs生產。d. 果糖-1,6-二磷酸酶過表達提高了FFAs的生產。e. NOG途徑與合成能量系統(tǒng)協(xié)作提高了FFAs的生產。f. 限糖限氮條件下SynENG058菌株的補料分批發(fā)酵。